(Малый Толмачевский переулок, дом № 9). В первый раз упоминается в документах 1625 г. Заменили деревянную церковь на каменный храм в 1690—1697 гг. Средства на его строительство пожертвовал купец Л.К. Добрынин. Главный престол храма освятили в честь праздника Сошествия Святого Духа, и до 1770 г. церковь в документах чаще называлась Сошественской, а потом ее опять стали именовать Никольской, видимо, уступая народному обычаю. Храм построили высокий, пятиглавый, с трапезной, в которой с юга находились придел святителя Николая и невысокая колокольня. В 1770 г. на средства купеческой вдовы Демидовой устроили придел Покрова Пресвятой Богородицы. К 1830-м гг. колокольня и трапезная совесем обветшали. 11 июля 1833 г. заложили новую колокольню и трапезную с двумя приделами (архитектор Ф.М. Шестаков). В 1836 г. соорудили ограду. Освятили вновь построенные приделы 25 ноября 1834 г. В 1845 г. трапезную расписал художник Малахов в академической манере. В 1856—1857 гг. переложили главный алтарь и растесали окна в основном храме. Главный иконостас переделали по образцу прежнего и освятили 5 октября 1858 г. В конце XIX в. храм был расписан диаконом Федором Соловьевым, который впоследствии принял монашеский постриг и прославился как схимонах Зосимовой пустыни Алексий (в 2000 г. причислен к лику святых).
Храм закрыли в 1929 г. Последний настоятель храма — священномученик протоиерей Илия Четвертухин, неоднократно был сослан и погиб в лагере во время пожара в 1932 г. Храм вошел в ансамбль зданий Третьяковской галереи. К церковному зданию стал примыкать один из корпусов, построенных в советское время. На втором этаже этого корпуса был расположен огромный зал, и в нем экспозиция, посвященная русскому художнику Александру Иванову. Картина Иванова «Явление Христа народу» располагалась на торцевой, самой прочной стене зала, и мало кто знал, что это была наружная стена Никольского храма. В самом храме в это время находилось хранение живописи. Реставрация началась в начале 1980-х годов вместе с реконструкцией всего комплекса галереи. Было решено открыть Никольский храм как домовую церковь Третьяковской галереи. Первые молебны прошли в храме в декабре 1993 г. С 1994 г. начались постоянные службы. Многие иконы Никольского храма находились в запасниках Третьяковской галереи — образа местного чина главного иконостаса и часть икон боковых приделов. Главный пятиярусный иконостас восстановили по старинным фотографиям, и недостающие иконы взяли из хранения галереи. Это иконы конца XVII века из снесенного в 1930-х годах храма святых Космы и Дамиана на Полянке.
В 1997 г., к 300-летнему юбилею храма, завершилось его восстановление. Была заново возведена стройная колокольня и восстановлено пятиглавие четверика. Отреставрированы иконостасы приделов, пристенные киоты, полностью восстановлена настенная живопись. На месте, где в храме обычно стоял его самый знаменитый прихожанин Павел Третьяков, была вделана в пол памятная доска. В дни празднования Владимирской иконы Божией Матери с 1991 г. в залах галереи перед чудотворным образом проводились молебны. Позднее чудотворную икону перенесли в храм, и она стала его главной святыней. Икона Святой Троицы преподобного Андрея Рублева осталась в залах Третьяковской галереи, а в Никольском храме находится ее точная фотокопия. Также в храме находятся многие иконы XVI—XX веков. Особо нужно отметить икону «Обретение мощей святого Сергия Радонежского», написанную на доске, вынутой из гроба преподобного. В подклете разместили крестильню с мраморной купелью.